在細胞培養實驗過程中，大家是不是總會好奇別人家的實驗總是做的又快又好，而自己做的實驗又慢又難得做出自己滿意的結果，搞得一天到晚也挺忙的，心想：我也很努力很認真啊，為啥效率總提不起來呢？

其實，有時候并不是自己不努力，只是沒有找對方法。做實驗可不能光是埋頭苦干，還要學會運用合適的檢測試劑盒，這樣就能事半功倍。

如果你還在用 MTT，那就真的 OUT 了，MTT 花 4 小時才能得到的結果用 CCK-8 只需 1 小時，CCK-8 可用于細胞增殖和毒性分析，同 MTT 法相比，CCK-8 即開即用，檢測時間大概在 1 小時左右。

不僅如此，CCK-8 對細胞的毒性極小，*可以測完細胞增殖或藥物毒性后再繼續用細胞進行下游實驗。下面小編就來為大家介紹一下 CCK-8 的具體情況。

CCK-8 基本原理

基本原理為：該試劑中含有 WST-8【化學名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2 H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體 1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產物（Formazan dye）。生成的甲臜物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。

圖 1. WST-8 檢測原理圖 EC=electron coupling reagent，即電子耦合試劑)

圖 2. CCK-8 檢測細胞活性原理圖

產品用途

主要用于藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗。

細胞毒性檢測的實驗對比

表 1. 細胞毒性檢測的實驗對比

CCK-8 的實驗方法與步驟

☆實驗一：細胞活性檢測

1. 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，96 孔板每孔加入 100 μL， 使待測細胞調密度至 （1,000~10,000）/ 孔。

2. 5% CO₂，37℃ 培養細胞 24 小時（培養時間根據細胞種類的不同和每孔內細胞數量的多少而異）。

3. 每孔加入 10 μL CCK-8 溶液。如果起始的培養體積為 200 μL，則需加入 20 μL CCK-8 溶液，其它情況以此類推。

4. 在細胞培養箱內繼續孵育 0.5~4 小時，對于大多數情況孵育 1 小時就可以了。時間的長短根據細胞的類型和細胞的密度等實驗情況而定（一般情況下，白細胞較難顯色，因此需要較長的 CCK-8 反應時間或增加細胞數量。懸浮細胞與貼壁細胞相比較難顯色。對于貼壁細胞，CCK-8 的培養時間一般為 1~4 小時，注意：CCK-8 的jia反應時間以具體顯色的jia時間為準）。初次實驗時可以在 0.5、1、2 和 4 小時后分別用酶標儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個時間點用于后續實驗。

5. 在 450 nm 測定吸光度。

☆ 實驗二： 細胞增殖 - 毒性檢測

1. 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，96 孔板每孔加入 100 μL， 使待測細胞調密度至 （1,000~10,000）/ 孔。

2. 5% CO₂，37℃ 培養細胞 24 小時（培養時間根據細胞種類的不同和每孔內細胞數量的多少而異）。

3. 加入 10 μL 不同濃度的待測物質，將培養板在培養箱孵育一段適當的時間 （例如 6、12、24 或 48 小時）。

4. 每孔加入 10 μL CCK-8 溶液。如果起始的培養體積為 200 μL，則需加入 20 μL CCK-8 溶液，其它情況以此類推。

5. 在細胞培養箱內繼續孵育 0.5~4 小時，對于大多數情況孵育 1 小時就可以了。時間的長短根據細胞的類型和細胞的密度等實驗情況而定（一般情況下，白細胞較難顯色，因此需要較長的 CCK-8 反應時間或增加細胞數量。懸浮細胞與貼壁細胞相比較難顯色。對于貼壁細胞，CCK-8 的培養時間一般為 1~4 小時，注意：CCK-8 的jia反應時間以具體顯色的jia時間為準）。初次實驗時可以在 0.5、1、2 和 4 小時后分別用酶標儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個時間點用于后續實驗。

6. 在 450 nm 測定吸光度。

圖 3. 實驗操作示意圖

☆ 注意事項：

如果待測物質有氧化還原性，可在加 CCK-8 之前更換新鮮的培養基，去掉待測物質的影響。

☆ 計算公式：

• 細胞存活率 = [（實驗孔 — 空白孔）/ （對照孔 — 空白孔）] × 100%

• 抑制率 = [（對照孔 — 實驗孔） / （對照孔 — 空白孔）] × 100%

• 實驗孔 （含有細胞的培養基、CCK-8、待測物質）

• 對照孔 （含有細胞的培養基、CCK-8、沒有待測物質）

• 空白孔 （不含細胞和待測物質的培養基、CCK-8） 

注意事項

1. 次做實驗時，建議先做幾個孔摸索接種細胞的數量和加入 CCK-8 試劑后的培養時間。

2. 接種時注意細胞懸液一定要混勻，以避免細胞沉淀下來，導致每孔中的細胞數量不一致。

3. 培養板周圍一圈孔培養液容易揮發，為減少誤差，建議培養板周圍的四邊每孔只加培養基。

4. 建議采用多通道移液器，減少平行孔間的誤差，加 CCK-8 時，建議斜貼著培養板壁加，不要插到培養基液面下加，容易產生氣泡，干擾 OD 值。

5. 若細胞培養時間較長，培養基顏色或 pH 發生變化，建議更換培養基后再加 CCK-8，含有酚紅的培養基不影響測定。

6. CCK-8 對細胞的毒性非常低，其他的實驗，例如中性紅法或結晶紫法 ，也可在 CCK-8 法檢測完后繼續進行。

7. 可以使用大于 600 nm 的波長，例如 650 nm，作為參考波長進行雙波長測定，CCK-8 在參比波長處沒有吸光值，設定參比波長的目的是為了去除由于樣品渾濁所帶來的吸收。

8. 如果實驗中待測物質有氧化還原劑，在不含細胞的培養基中加入藥物，然后加入 CCK-8 試劑在一定時間內檢測，和不加藥物的培養基進行比較 （只加 CCK-8 試劑），如果 OD 值明顯偏高，則說明有反應。

9. 加 CCK-8 試劑時速度要快，減少試劑在移液器上的殘留，加入 CCK-8 試劑后輕輕震培養板，為了避免加樣時由于 CCK-8 殘留在槍頭上所帶來的誤差，可以在加樣前用培養稀釋 CCK-8 試劑并混勻后加樣。

10. CCK-8 反復凍融會增加背景值，干擾實驗測定。

CCK-8 常見問題解答

☆ CCK 的保存和穩定性如何？

答：CCK 穩定性高，避光條件 -20℃ 有效期 2 年，4℃ 有效期 1 年。經常使用建議 4℃ 保存，避免反復凍融。CCK 正常顏色為粉紅色，若顏色發生明顯偏差，質量可能有發生變化。

☆ CCK 會對活細胞進行染色嗎？

答：不會，首先 WST-8 不會進入細胞染色，整個顯色反應都是在培養體系中進行的。另外 WST 和 WST-8 甲臜都屬于高度水溶性組分，反應結束更換新的培養液，即可清除外源組分。

☆在加入 CCK-8 時可否不更換培養基？

答：一般情況下可以不更換培養基。但是如果培養基里有氧化還原性物質的話，有可能會產生誤差，必須更換其它培養基。

☆ 若是使用 6 孔或者 24 孔板進行試驗，CCK 試劑使用量怎么樣呢？

答：如果要使用 6 孔板或 24 孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養基總體積的 10% 加入 CCK 溶液。

☆ 能否用 384 孔板進行細胞增殖與活性檢測的實驗呢？

答：可以，CCK-8 產品的使用量為每孔培養基總體積的 10%。建議先將 CCK-8 產品稀釋一倍，然后加入培養基總體積的 20% 即可，這樣可減少誤差。

☆ 只可以在 450 nm 波長處測 OD 值嗎？

答：可以在 450 nm 波長處測 OD 值，但是若無此波長的濾光片，可選擇吸光度在 430~490 nm 之間的濾光片，但是 450 nm 濾光片的檢測靈敏度高。

☆ 若是暫不檢測 OD 值，該如何處理？

答：若暫時不測定 OD 值，可以向每孔中加入 10μL0.1 M 的 HCl 溶液或者 1% w/v SDS 溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24 小時內測定，吸光度不會發生變化

☆ 在實驗中 OD 值太高，怎么解決？

答：可以縮短加入 CCK-8 后的培養時間。例如：可以把加入 CCK-8 試劑后的培養時間由 2 小時縮短為 1 小時。此外，可適當減少細胞的數量。

☆ 如果 OD 值太低，怎么解決？

答：可以采取 2 個辦法：1、適當增加細胞數量；2、延長加入 CCK-8 試劑后的反應時間。

☆ 應該每次做標準曲線嗎？

答：建議每次做。雖然細胞是一樣的，但是細胞的狀態不一定一樣。對于狀態不一樣的細胞，建議每次做標準曲線。