TFAR19(PDCD5)是由本研究室在上首先報導的一個擁有自己知識產權的人類新基因,前期的功能研究表明,它是促進細胞凋亡的增強劑.利用熒光素(FITC)標記的TFAR19單克隆抗體為探針,對細胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達水平及定位研究發現,凋亡早期TFAR19表達水平增高并出現快速核轉位現象,伴隨著細胞核形態學的變化,持續較長時間,在凋亡小體中仍然可見.
同時我們發現,凋亡早期TFAR19蛋白的核轉位早于磷脂酰絲氨酸(PS)外翻和細胞核DNA的片段化,提示TFAR19蛋白的核轉位是細胞凋亡更早期發生的事件之一.進一步的研究證明,凋亡早期TFAR19的核轉位具有普遍意義,不同細胞凋亡早期均出現TFAR19高表達和核轉位.這為研究細胞凋亡早期所發生的事件,提供了一種新的技術和指標.
(一)TFAR19蛋白的細胞定位分析
材料試劑:
FITC標記的單克隆抗體,pH7.4 、0.15Mol/L PBS,3%的多聚甲醛,PBS-T(pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20),胎牛血清,熒光細胞洗液:pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 .FACS管,Tip頭,移液器.
儀器:低溫水平離心機, 37°C水浴箱,熒光顯微鏡,共聚焦激光掃描顯微鏡,流式細胞計方法:
1 懸浮細胞的染色:
(1)收獲正常和誘導凋亡的細胞(0.5~1′106),PBS洗2次,1000rpm′10min.
(2)3%多聚甲醛冰浴10min,PBS洗2次,1000rpm′10min.
(3)加入PBS-T溶液,37°C孵育15min,PBS洗2次,1000rpm′10min.
(4)加入200ml胎牛血清,室溫反應30min.
(5)加入5ml FITC標記的TFAR19單抗(終濃度為1:40),4°C反應30min(6)熒光細胞洗液洗2次,1000rpm′10min.
結果觀察:將細胞沉淀滴片,熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細胞中的定位.同時用流式細胞計定量檢測TFAR19蛋白的平均熒光強度.[圖12]
2:貼壁細胞的原位染色
(1) 貼壁生長的對數期細胞鋪在24孔或6孔板中(內有潔凈蓋玻片),讓其爬片生長,待長到50%~80%滿時,凋亡誘導劑處理細胞.
(2) 將不同時間點處理的細胞進行免疫熒光染色,染色步驟同上.
(3) 將染色的爬片細胞放于一張滴有少量甘油(5ml)的載玻片上,熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微鏡觀察TFAR19在細胞中的定位.
結果觀察:
3:臨床病理切片的染色、檢測.
4:原代細胞的培養、檢測.
5:分析TFAR19蛋白在人體內各組織器官的分布及定位(二)TFAR19蛋白的表達與臨床疾病
1. ELISA法檢測正常人和疾病狀態下,以及疾病的不同時期,血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗體水平.
材料和試劑:
1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸鹽Buffer
2. 洗滌液: pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 203. 封閉液: 3%BSA(用洗滌液配制)
4. 酶標抗體的稀釋:用封閉液稀釋
5. OPD底物Buffer:Na2HPO4.12H2O 1.84g
檸檬酸 0.51g
DDW 100ml
6. 顯色液(現配現用):底物Buffer 10ml
OPD 2mg
30% H2O2 2ml
7. 終止液 2Mol/L H2SO48. 重組人TFAR19, HRP標記的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器,ELISAReader(OD490nm),洗板機
操作步驟：
1. 用包被Buffer稀釋的重組人TFAR19(1mg/ml)包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C過夜(一般24h以上).
2. 洗滌Buffer洗板三次,加入封閉液,200 ml/well , 37°C孵育2h或4°C過夜.
3. 洗滌Buffer洗板三次,加入不同稀釋度的病人血清(3個重復孔)100ml/well ,37°C孵育1h.設包被Buffer、洗滌Buffer 、封閉液為陰性對照.
4. 洗滌Buffer洗板三次,加入1:2500稀釋的HRP標記的抗人IgG, 100ml/well,37°C孵育1h.
5. 洗滌Buffer洗板三次,加入顯色液,100 ml/well,避光反應10~15min.
6. 加入H2SO4終止反應,50 ml/well.
7. ELISA Reader 讀取OD490 光密度值,分析和比較病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗體的表達水平.
2. Western blot 分析原發性腫瘤細胞和正常細胞的TFAR19蛋白的表達水平.
