實(shí)驗(yàn)概要

可溶性抗原與相應(yīng)抗體在半固體瓊脂凝膠內(nèi)擴(kuò)散，二者相遇，在比例合適處形成白色沉淀。基本類型有單向擴(kuò)散和雙向擴(kuò)散兩種。本文介紹了單向和雙向兩種瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的操作流程。單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)主要用于檢查血清中各種免疫球蛋白和補(bǔ)體成份的含量；雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)可用來(lái)分析和鑒定標(biāo)本中多種抗原或抗體成份，并用以測(cè)定抗原或抗體的效價(jià)。

實(shí)驗(yàn)原理

1. 單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是一種定量試驗(yàn)，將抗體混合于瓊脂內(nèi)，傾注于玻片或平皿上，凝固后在瓊脂上打孔，再將抗原標(biāo)本加入孔內(nèi)，經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間，在孔的周圍出現(xiàn)抗原抗體復(fù)合物形成的沉淀環(huán)，環(huán)的大小與抗原含量和擴(kuò)散時(shí)間相關(guān)。用不同濃度的抗原制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，則未知標(biāo)本中的抗原含量即可從準(zhǔn)標(biāo)曲線中求出。

2. 抗原和抗體加到瓊脂板上相對(duì)應(yīng)的孔中，兩者各自向四周擴(kuò)散，如兩者相對(duì)應(yīng)，濃度比例合適，則經(jīng)一定時(shí)間后，在抗原、抗體孔之間出現(xiàn)清晰致密的白色沉淀線。每一抗原與其相對(duì)應(yīng)抗體只能形成一條沉淀線，若同時(shí)含有若干對(duì)抗原抗體系統(tǒng)，因其擴(kuò)散速度的不同，可在瓊脂中出現(xiàn)多條沉淀線。且根據(jù)沉淀線融合情況，還可鑒定兩種抗原是*相同還是部分相同。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(Single immunodiffusion test)-人血清中IgG、IgA、IgM的測(cè)定

   1) 材料

IgG、IgA、IgM免疫板、參考血清、待檢血清、微量加樣器(10微升)、量尺、紗布、生理鹽水、帶蓋方盤。

   2) 方法

      a. 免疫瓊脂板制備：將1.5%瓊脂(用PH8.2、0.05M的巴比/妥緩沖液配成)，加熱溶化，待瓊脂冷至56℃加入適量抗血清(抗血清最終稀釋度取決于抗血清所標(biāo)化的稀釋度)，混勻，制成厚1.5mm的瓊脂板，待瓊脂凝固后打孔，孔徑為3mm，孔距1～1.2cm。

      b. 稀釋參考血清及待檢血清：參考血清用0.5ml蒸餾水溶解后使用，參考血清、待檢血清稀釋按要求進(jìn)行。

      c. 加樣：將上述稀釋參考血清分別滴入相應(yīng)的抗體免疫板的一排孔內(nèi)，其余孔滴加待檢的稀釋血清，每個(gè)檢樣加兩個(gè)孔，每孔滴加10微升。

      d. 擴(kuò)散：將免疫板置水平濕盤內(nèi)，放進(jìn)37℃溫箱，IgG免疫板擴(kuò)散24小時(shí)，IgA、IgM板48小時(shí)后取出置黑色背景前觀察結(jié)果，(如果沉淀環(huán)不清晰，也可用1%鞣酸液浸泡免疫板半小時(shí)后觀察)，必要時(shí)可以染色后觀察。

      e. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及血清標(biāo)本中IgG、IgA、IgM定量測(cè)定：測(cè)量沉淀環(huán)直徑。沉淀環(huán)直徑的大小除與抗原量相關(guān)，還與分子量和擴(kuò)散時(shí)間有關(guān)。這種沉淀環(huán)直徑與抗原含量的關(guān)系不是直線相關(guān)，而是對(duì)數(shù)關(guān)系，這種關(guān)系有兩種計(jì)算方法：

      Mancini曲線－適用于大分子抗原和長(zhǎng)時(shí)間擴(kuò)散(＞48小時(shí))的結(jié)果處理。使用方格計(jì)算紙劃線，沉淀環(huán)直徑的平方與抗原濃度呈線性關(guān)系。公式表示：C／d2 ＝K(C＝抗原濃度，d＝沉淀環(huán)直徑，K＝常數(shù))。

      Fehey曲線－適用于小分子抗原和較短時(shí)間(24小時(shí))擴(kuò)散的結(jié)果處理。使用半對(duì)數(shù)紙劃線，濃度的對(duì)數(shù)與沉淀環(huán)之間呈線性關(guān)系。公式表示：logC／d＝K(C＝抗原濃度，d＝沉淀環(huán)直徑，K＝常數(shù))。

2. 雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(Double immunodiffusion test)

   1) 材料

羊抗人全血清，小牛血清，正常人混合血清，精制瓊脂粉，生理鹽水、載玻片，打孔器(直徑3mm)、濕盒、吸管等。

   2) 方法

      a. 用生理鹽水配制1.0～1.5%瓊脂，隔水煮沸使溶化，用吸管吸取3.5ml趁熱澆于載玻片上，制成瓊脂板。

      b. 待瓊脂凝固后，按右圖用打孔器打孔，并用針頭挑去孔中瓊脂(孔距為5mm)。

      c. 在①孔中加正常人混合血清，在②孔中加小牛血清，③孔中加羊抗人全血清，注意不要溢出。

      d. 將加好樣品的瓊脂板置于濕盒內(nèi)，于37℃溫箱內(nèi)放置24小時(shí)后觀察結(jié)果。