1.  為什么免疫后沒有效價或免疫后效價低？

答：可以從這幾個方面一一考慮：

（1）設(shè)計的抗原與被免疫的動物內(nèi)源蛋白有*的同源性或者抗原是免疫原性極差的小分子物質(zhì)。對于前一種情況應(yīng)該重新設(shè)計抗原，設(shè)計抗原時盡量選取目標蛋白特異性的序列，可以設(shè)計為短肽然后再與載體蛋白偶聯(lián)之后免疫；對于后一種情況，首先確認小分子物質(zhì)是否已經(jīng)正確地和載體蛋白偶聯(lián)，如果偶聯(lián)沒有問題，可以更換其它的載體蛋白，一般來說KLH是所有載體中較為優(yōu)先考慮的蛋白。

（2）免疫的周期不正確。免疫周期過長或過短，各免疫步驟之間的間隔過長或過短都有可能影響免疫效果，詳細請參考本站有關(guān)動物免疫的部份，實際操作中的相關(guān)程序與本站推薦的程序相差盡里不超過50%的偏差。

（3）免疫佐劑不合適。TiterMax等佐劑在免疫時，對于某些抗原可能效果不佳，弗低佐劑也不能保證*有效，此時可以考慮更換佐劑嘗試。

（4）免疫劑量不合理。過大的免疫劑量可能導(dǎo)致免疫耐受，過少的免疫劑量可能無法激活免疫應(yīng)答。一般來說，實際免疫劑量與本站所推薦的劑量不要相差兩倍以上。

（5）免疫途徑不合理。對于有些免疫原性弱的抗原，可以考慮脾內(nèi)免疫方法，具體操作本站上也有詳細的講解。

（6）測效價的過程存在錯誤操作，尤其考慮包被是否成功或二抗使用是否正確。同時，一抗（即血清）稀釋梯度盡量放寬，一般建議從1：500或1：1000開始作梯度稀釋。對于小分子物質(zhì)，效價達到1：2000仍可視為免疫成功。

2.  為什么融合后細胞不長或者融合后克隆很少？

答：可以從這幾個方面考慮：

（1）免疫用的動物品系不正確或者品系不純。免疫用的動物一般應(yīng)該與骨髓瘤來源的動物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤細胞時應(yīng)該選用Balb/C小鼠，同時必須使用品系純正的小鼠。

（2）培養(yǎng)基中加入了過高濃度的HAT，或者僅A的濃度過高或HT的濃度過低，建議用純的骨髓瘤和已有的雜交瘤作HAT濃度篩選。

（3）培養(yǎng)基不正確或血清濃度不正確或使用了劣質(zhì)血清。

（4）未正確制備飼養(yǎng)層細胞。參見本站有關(guān)飼養(yǎng)層細胞制備的部份。

（5）接種雜交瘤細胞的培養(yǎng)板過多。一般在5-20塊96孔板為宜。

（6）融合后，未及時轉(zhuǎn)移或稀釋細胞。有人在做融合后喜歡把融合的細胞先放在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，然后再滴到96孔板上。如果在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的時間過長，也可能出現(xiàn)克隆利率少的情況。

（7）細胞被污染。在顯微鏡下仔細觀察是否有明顯的微生物污染。即使看不到有明顯的微生物，也應(yīng)該考慮是否有支原體污染，有條件的可以做支原體檢測。

（8）細胞培養(yǎng)條件不正確，確保細胞培養(yǎng)在恒定的37度較濕的環(huán)境，同時保證CO2濃度在4-5%左右。

（9）其它與融合條件相關(guān)的不恰當?shù)囊蛩亍Ｔ斠姳菊居嘘P(guān)細胞融合的部份。

3.  為什么融合后得不到陽性克隆？

答：可能的原因：

（1）動物未免疫成功就進行了融合。具體解決方法參照本頁面第1個問題。

（2）融合后得到的克隆較少，故得到陽性克隆的機率也較小。具體解決方法，請參照本頁面第2個問題。

（3）篩選克隆手段不正確。例如有些小分子物質(zhì)不可以直接包被到酶標板上，再如使用了不適當?shù)亩沟戎T多因素，也有人直接不使用ELISA作為篩選方法的，成功率也有待商榷。

（4）抗原成份與細胞培養(yǎng)條件中的物質(zhì)相同或類似，或者與篩選過程中有同抗原結(jié)構(gòu)相同或類似的物質(zhì)產(chǎn)生了競爭反應(yīng)。舉個簡單的例子，如果需要制備抗BSA 的單抗，則養(yǎng)雜交瘤的培養(yǎng)基中不可以使用牛血清，否則牛血清中的BSA直接與抗體相結(jié)合，最后做ELISA篩選的時候無法得到陽性結(jié)果。解決的辦法只有使用其它的動物的血清或者使用無血清培養(yǎng)基。再如，如果需要制備酪蛋白的單抗，則做ELISA篩選時，二抗的稀釋液不可以使用脫脂奶粉。

（5）其它所有能影響ELISA等相關(guān)篩選手段的因素。這一部份詳見本站有關(guān)ELISA實驗的講解與討論。

4.  為什么我的細胞生長很慢？

答：可能的原因：

（1）使用了劣質(zhì)的培養(yǎng)耗材、培養(yǎng)基、血清、HAT或HT。建議新手使用知/名廠商的試劑或耗材。對于血清，可能需要從多個廠家選用多個批次試用，選擇出比較好的批次進行實驗。在試用血清的時候，一般可以使用相對較低濃度的血清進行骨髓瘤細胞培養(yǎng)實驗，根據(jù)骨髓瘤細胞的倍增速度確實血清質(zhì)量。

（2）使用的血清或培養(yǎng)基濃度不正確。仔細檢查配方是否正確。

（3）制備飼養(yǎng)層的方法不正確。參見本頁面第二個問題。

（4）其它問題，可以參考本頁面第二個問題。

5.  我的克隆原來是陽性的，為什么后來轉(zhuǎn)為陰性了？

答：首先要注意的是，正常情況下，雜交瘤也不是絕對穩(wěn)定的，確實容易發(fā)生染色體丟失的情況，尤其是當細胞移到新環(huán)境中生長，如從小孔擴大到大孔，或者復(fù)蘇操作時，更容易發(fā)生陽性變?yōu)殛幮浴５且灿幸恍┺k法盡量減少陽性變?yōu)殛幮缘霓k法。一般可以從這幾個方面加以注意：

（1）永遠保證細胞處在最佳的生長環(huán)境中。尤其是培養(yǎng)基不能長期不換，一般來說，當細胞增長到一定密度的時候，培養(yǎng)基就開始變顏色，這個時候就要準備換培養(yǎng)基了，除了換培養(yǎng)基，同時應(yīng)該控制好細胞的密度，可以吹走過多的細胞，使新加入的培養(yǎng)基不至于很快被消耗。

（2）對于重要的細胞株，每一步都把陽性的細胞保種。

（3）不要過于頻繁操作細胞，當細胞生長密度不是很大的時候，不要頻繁操作，否則細胞容易出現(xiàn)死亡或者生長形態(tài)發(fā)生明顯變化。

（4）對于傳代次數(shù)較多的細胞株需要經(jīng)常進行亞克隆，并將每一次的亞克隆株也作凍存。

（5）當細胞被支原體等微生物污染，也會發(fā)生由陽性轉(zhuǎn)為陰性的情況。

6.  為什么我做亞克隆后長不出克隆來？

答：亞克隆失敗的原因和克隆不長的原因類似，但是除此之外，也還有一些*的原因。

（1）亞克隆時，原始孔里的細胞狀態(tài)不好，經(jīng)過有限稀釋或其它手段亞克隆的細胞活性很差，以至于長不出克隆。

（2)亞克隆時，沒有按照正確的數(shù)量取出細胞，在本站有關(guān)亞克隆操作的頁面上提到過，亞克隆的過程服從泊松分布，如果取出的細胞遠遠低于平均每孔一個細胞，或有效細胞遠遠低于平均每孔一個細胞，則也可能出現(xiàn)長不出克隆的結(jié)果。

（3）未添加飼養(yǎng)層細胞。單個細胞在*培養(yǎng)基中極難培養(yǎng)，如果不添加飼養(yǎng)層細胞，則它們很可能很快就死亡，最終就長不出克隆。

（4）使用的HAT中HT失效或A的濃度過高，或者未添加HT。 雖然HT對雜交瘤的生長并不是必須的，但是HT確實可以加快細胞生長，改善細胞生長狀態(tài)。

（5）使用無血清培養(yǎng)基。這一點是很冷僻的一個因素。雖然很少有人使用無血清培養(yǎng)基制備單抗，但是在某些血清可能干預(yù)篩選步驟的實驗的時候，可能會選用無血清培養(yǎng)基來培養(yǎng)雜交瘤，但是需要注意的是，在很多種無血清培養(yǎng)基中，單個細胞是很難長成克隆的。最/好的解決辦法就是先用含有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)它們，等克隆長出后再把培養(yǎng)基*更換為無血清培養(yǎng)基。

7.  為什么我凍存的細胞很難復(fù)蘇或者復(fù)蘇不活？ 

答：這個問題要從兩個方面來回答，一是凍存方面，二是復(fù)蘇問題。 對于凍存過程，需要注意：

（1）凍存液的配方。這個問題很關(guān)鍵，一個良好的凍存液配方可以使細胞保存得非常好，而一個不好的凍存液配方可能會讓細胞傾刻死亡。目前認為比較好的配方有：10%DMSO+90%胎牛血清和10%DMSO+90%養(yǎng)過雜交瘤的培養(yǎng)基，不管是哪一種，凍存保護劑DMSO的含量非常重要，如果這個濃度過低，則起不到保護作用，凍存的細胞最終會死于冰晶形成時的張力，如果濃度過高，則細胞中毒而亡。如果使用第二個配方，注意一定要用養(yǎng)過雜交瘤的培養(yǎng)基，而盡量不要用一般的*培養(yǎng)基，而且一定是配養(yǎng)需要凍存的那一株的培養(yǎng)基。文獻中也有提到用甘油作為凍存保護劑的，站長自己沒有親自試過，不發(fā)表評論。如果新手確實對這個沒把握，市場上也有商品化的凍存液，買回來按照說明書操作就OK了。

（2）凍存過程中，不可用力過大，在凍存液中重懸細胞的時候更是要輕柔，因為在DMSO存在的條件下，細胞膜變得非常脆弱，如果用力過猛，則細胞膜很容易破，復(fù)蘇成活的機會就明顯會下降。

（3）凍存的程序也非常重要。實踐表明，以每分鐘1 ℃的速度下降凍存細胞是最/理想的。如果條件簡易，可以把細胞放在4 ℃半小時左右，然后再在-20 ℃放置1-2小時，最后轉(zhuǎn)入-80 ℃放置過夜，最終轉(zhuǎn)入液氮保存。需要短期保存的，直接放-80 ℃也行。現(xiàn)在市場上有比較貴的凍存盒，把需要存放的細胞放進去，然后直接放-80 ℃就行，等時間夠長后直接轉(zhuǎn)至液氮中即可。

（4）細胞需要保存在液氮的氣相中，而不是泡在液相里。否則液氮很容易進入凍存管。這一點很多人都沒有注意，大部份人都是直接往液相里放，其實這是錯誤的。有人認為，普通的液氮中可能含有微生物或者孢子什么的，如果放在液相中，這些微生物或孢子就有機會進入凍存管，最終可能造成細胞污染。

（5）保證被凍存的細胞處于良好的生長狀態(tài)，并且沒有被污染。 

對于復(fù)蘇過程，需要注意：

（1）快速。為了防止升溫中細胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶，強烈建議加快融化過程。一般都要用用足夠體積的37 ℃熱水復(fù)蘇，并不斷晃動凍存管。

（2）復(fù)蘇過程不要把凍存管全部泡入水中，也不要把蓋子弄濕，否則熱水有可能污染管口，造成復(fù)蘇的細胞被污染。

（3）有的人復(fù)蘇細胞時，沒有去掉凍存液，這樣就把凍存液里的DMSO帶到了新的培養(yǎng)體系里，容易對細胞造成毒害，因此強烈建議將融化的細胞離心后去掉凍存液，然后用新的*培養(yǎng)基重懸，再接種到新的容器內(nèi)培養(yǎng)。

8.  為什么我的細胞總是污染？如何可以救活污染的細胞？

答：養(yǎng)細胞出現(xiàn)污染，幾乎是每個細胞培養(yǎng)技術(shù)員容易出現(xiàn)的問題。要防止細胞污染，無非就是保證培養(yǎng)環(huán)境無污染，保證所用的所有試劑都無污染源，同時提高操作時的警惕性，這些基本的知識這里就不再廢話了。