隨著新/冠疫情的發(fā)展，新/冠病毒核酸的檢測(cè)工作已趨于常態(tài)化。而優(yōu)質(zhì)的核酸提取試劑是核酸檢測(cè)的基礎(chǔ)，正確提取核酸才能保證下游檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量。

　　市場(chǎng)上核酸提取的試劑成分雖然各有差別，但蛋白酶K由于其獨(dú)/特的廣譜蛋白水解酶活性和穩(wěn)定性，目前已成為了多種提取試劑的重要原料。另外，在臨床實(shí)踐中，特別是我國(guó)目前正在推行20混1檢測(cè)的場(chǎng)景下，難免會(huì)遇到復(fù)雜樣本（例如含有“痰液"的樣本）；而蛋白酶K在處理特殊樣本時(shí)，更能突顯出作用。

　　蛋白酶K廣泛應(yīng)用于核酸提取

　　蛋白酶K來(lái)源于林伯氏白色念球菌，是一種絲氨/酸蛋白酶，具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性和廣譜蛋白水解酶活性，目前廣泛應(yīng)用于核酸提取中。

　　01、【廣譜蛋白水解酶活性】

　　蛋白酶K可作用于多種蛋白，在病毒核酸提取檢測(cè)中發(fā)揮多重作用：

　　（1）裂解病毒的外殼蛋白，暴露核酸分子，并且病毒外殼蛋白失活可進(jìn)一步保證運(yùn)輸和檢測(cè)階段更安全；

　　（2）降解與核酸緊密結(jié)合的組蛋白，使得核酸游離到提取液中，有利于進(jìn)一步純化；

　　（3）降解RNA酶，防止病毒RNA的降解，有利于核酸檢測(cè)。

　　02、【穩(wěn)定性】

　　蛋白酶K能在多種環(huán)境[pH（4-12.5），高鹽緩沖液，70℃的高溫等]中保持活性。另外，蛋白酶K的活性不受SDS、尿素、EDTA、鹽酸胍、異硫氰酸胍等的抑制，且一定含量的去垢劑還可以增強(qiáng)蛋白酶K的活性。

　　03、蛋白酶K在新/冠指南、政策文件均有推薦

　　學(xué)術(shù)指南和政策文件中，均提及蛋白酶K的應(yīng)用。

　　早在2020年4月疫情暴發(fā)伊始，中華醫(yī)學(xué)雜志發(fā)布了《2019新型/冠狀病毒核酸檢測(cè)專家共識(shí)》，提出收集痰液于采樣杯中，采樣杯里需裝入2mL蛋白酶K（1g/L）。

　　2020年7月13日，國(guó)務(wù)院發(fā)布了《醫(yī)療機(jī)構(gòu)新/冠病毒核酸檢測(cè)工作手冊(cè)（試行第二版）》，文中指出，如果痰液未收集于采樣液中，可在檢測(cè)前，加入2～3mL采樣液，或加入與痰液等體積的含1g/L蛋白酶K的磷酸鹽緩沖液將痰液化。

　　2021年5月，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布《新型/冠狀病毒肺炎防控方案（第八版）》，文中提及處理痰液樣本時(shí)，可采用痰液等體積的含1g/L蛋白酶K的磷酸鹽緩沖液將痰液化。

　　04、相關(guān)研究提示蛋白酶K對(duì)復(fù)雜樣本核酸提取具有重要作用

　　新/冠的核酸采樣主要采集口咽拭子和鼻咽拭子樣本，但在臨床實(shí)際工作中，難免會(huì)采集到一些復(fù)雜樣本，例如：痰液等。《2019新型/冠狀病毒核酸檢測(cè)專家共識(shí)》中引用的研究[4]提示，在復(fù)雜樣本的提取核酸，使用蛋白酶K效果更佳。

　　在該研究試驗(yàn)中，SungH等采用了蛋白酶K和其他兩種方法，提取痰液標(biāo)本中的核酸（RNA），并使用熒光PCR儀對(duì)三種方法提取的核酸進(jìn)行分析比較。試驗(yàn)顯示，另外兩種方法提取核酸檢測(cè)結(jié)果中，假陰性率分別為16.7%和13.3%；使用了蛋白酶K處理的樣本，檢測(cè)結(jié)果并無(wú)假陰性。另外，蛋白酶K組PCR檢測(cè)的Ct值范圍在31.1-35.4之間，而另外兩種方法學(xué)PCR檢測(cè)的Ct值范圍分別為34.7-39.0和33.9-38.6。

　　另外，Saber Khelaifia等對(duì)糞便標(biāo)本中的細(xì)菌DNA進(jìn)行提取，結(jié)果顯示使用蛋白酶K可以提高DNA的提取量。Tomoo Jikuzono使用蛋白酶K對(duì)液基細(xì)胞溶液固定的甲狀腺細(xì)胞進(jìn)行處理后，提高了RNA回收率。

　　蛋白酶K增加核酸提取量可能的原因?yàn)椋?br/>
　　（1）復(fù)雜樣本（如：痰液樣本）中存在著一些可PCR反應(yīng)的物質(zhì)（可抑制PCR的物質(zhì)，例如糖蛋白，免疫球蛋白等物質(zhì)就是PCR的抑制物），使用了蛋白酶K可最/大程度清除該類物質(zhì)，保證PCR結(jié)果準(zhǔn)確性；

　　（2）復(fù)雜樣本的核酸提取過(guò)程中，易殘留較多RNA酶，使用蛋白酶K可最大/程度滅活RNA酶，防止病毒RNA的降解，有利于核酸檢測(cè)。

　　也有一些研究提示，蛋白酶K在復(fù)雜樣本的處理中并未顯示突出作用。這可能與使用的蛋白酶K活性不同有關(guān)，另一種可能是與使用場(chǎng)景有關(guān)，蛋白酶K加入裂解液之中，若作者長(zhǎng)時(shí)間放置，蛋白酶K會(huì)失活，此時(shí)就會(huì)得到加不加蛋白酶K沒(méi)有作用的結(jié)論），未來(lái)仍需大量研究進(jìn)一步探索。

　　目前，新/冠疫情依然在全球肆虐，核酸提取檢測(cè)已趨于常態(tài)化。在臨床實(shí)踐中，特別是“10混1"或“20混1"檢測(cè)的場(chǎng)景下，難免會(huì)遇到復(fù)雜樣本（例如含有“痰液"的樣本）；而蛋白酶K在處理特殊樣本具有獨(dú)/特作用。未來(lái)我們需進(jìn)一步深挖多種提取檢測(cè)使用場(chǎng)景，探索最佳使用方案，以期更好的控制疫情。