傳統(tǒng)方法

常規(guī)宏觀菌落形態(tài)學(xué)觀察,主要觀察菌落在其適合的培養(yǎng)基上的生長狀況:細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上的生長形態(tài)、大小、顏色是否均勻一致,菌落個(gè)體表面及邊緣的生長狀況；在液體培養(yǎng)基上的渾濁狀況、沉淀狀況、液面菌膜狀況；半固體上穿刺接種后,觀察細(xì)菌是否沿著接種線生長以及其生長狀態(tài)是呈毛刷樣生長還是均勻生長,上下生長是否一致.在鑒別培養(yǎng)基上培養(yǎng),觀察結(jié)果是否跟預(yù)期結(jié)果相同。

細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)學(xué)觀察,即通過顯微鏡觀察.觀察前細(xì)菌需要著色,要根據(jù)預(yù)先確定的觀察項(xiàng)目選擇與之相對應(yīng)的染色方法,目前常用的染色方法包括革蘭氏染色法、美藍(lán)染色法、Ziehl—Neelsen染色法、姬姆薩染色法、鞭毛染色法、芽胞染色法等.盡量挑選對數(shù)生長期的細(xì)菌進(jìn)行染色觀察,此時(shí)的細(xì)菌生長處于幼期,利于觀察,因?yàn)橐恍╆惻f細(xì)菌的染色結(jié)果會有變化,如本為革蘭氏陽性菌經(jīng)過長期擱置后染色結(jié)果可能為革蘭氏陰性.同時(shí)細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)要注意培養(yǎng)基的挑選,一些細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)如莢膜、鞭毛、菌毛、芽胞等,其表達(dá)是需要在特定的培養(yǎng)基上才能正常發(fā)育,有的細(xì)菌如炭疽在一般的培養(yǎng)基上不形成莢膜,只在動(dòng)物體內(nèi)形成明顯的莢膜,所以需先接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后用病料進(jìn)行涂片鏡檢.在鏡檢時(shí)觀察細(xì)菌基本形態(tài)結(jié)構(gòu)和大小及其排列狀態(tài)、菌端形狀、有無兩極染色、有無形成芽胞和莢胞等。

形態(tài)學(xué)鑒定輔以生化試驗(yàn)在細(xì)菌鑒定中具有重要的意義,生化試驗(yàn)是根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)過程中不同菌種所產(chǎn)生的新陳代謝產(chǎn)物各異,表現(xiàn)出不同的生長特性.通過生物化學(xué)的方法來檢測這些物質(zhì)的存在與否,從而能夠得到細(xì)菌的鑒定結(jié)果.如糖(醇)類代謝試驗(yàn)、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)、有機(jī)酸鹽和胺鹽利用試驗(yàn)、呼吸酶類試驗(yàn)、毒性酶類試驗(yàn)等。

血清型鑒定是根據(jù)細(xì)菌具有相對特異性的抗原結(jié)構(gòu)這個(gè)特點(diǎn)進(jìn)行微生物鑒定的特異方法.抗原的特異性程度又存在于屬間細(xì)菌所共有的共同抗原,這種抗原的存在,能表明其屬性。另一類特異性抗原只存在于特定的種、型,是確定細(xì)菌種、型的重要依據(jù)，通過專門的分型血清即可對這些細(xì)菌的血清型進(jìn)行鑒定。

細(xì)菌毒力的測定,病原菌侵入機(jī)體能否引起疾病與其本身的毒力、侵入機(jī)體的數(shù)量和侵入部位有關(guān).不同的病原菌或同種細(xì)菌不同的型或株,毒力常不一致.常用LD50或ID50表示毒力,即在一定時(shí)間內(nèi),能使一定條件的某種動(dòng)物半數(shù)死亡或感染需要的最小細(xì)菌數(shù)或毒素量.毒力測定在菌種鑒定過程中可用于鑒別一些有代表性的菌株.LD50可用Reed—Muench公式進(jìn)行計(jì)算。

儀器自動(dòng)化鑒定

隨著儀器分析技術(shù)的進(jìn)步和計(jì)算機(jī)的廣泛應(yīng)用,微生物菌種鑒定逐漸由傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察和人工生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定發(fā)展進(jìn)入了基于儀器自動(dòng)化分析的鑒定系統(tǒng)階段。近年來,一系列自動(dòng)鑒定系統(tǒng)相繼推出,并在應(yīng)用中取得理想效果。

分子生物學(xué)鑒定

分子生物學(xué)鑒定目前比較流行的主要是核酸檢測技術(shù),包括基因測序、指紋圖譜技術(shù)、基因探針技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、GC含量測定等.PCR和核酸雜交單獨(dú)或結(jié)合在儀器已經(jīng)形成比較經(jīng)典的核酸檢測技術(shù),目前這兩者已經(jīng)得到了較大范圍的推廣和應(yīng)用。

核酸檢測技術(shù)原理

DNA的G+C含量測定法

這種方法是根據(jù)細(xì)菌的DNA中G+C含量的特異性來進(jìn)行細(xì)菌鑒定,通過熔解溫度(Tm)法或浮力密度法測定細(xì)菌DNA中G+C的含量,通過對比來鑒定細(xì)菌。

16S rRNA鑒定

細(xì)菌的核糖體RNA(rRNA)基因高度保守且進(jìn)化速度緩慢,在漫長的進(jìn)化過程中保留了rRNA基因結(jié)構(gòu)和功能的同源性,在微生物染色體上可存在多個(gè)拷貝,以rRNA基因片段為探針可檢出含有rRNA基因的DNA片段.分析雜交后得到的rRNA指紋圖,為菌種定型和近緣菌株的鑒定提供了一種新技術(shù).針對rRNA基因的核糖體分型可成功地區(qū)分多個(gè)菌種的相關(guān)菌株,因此該技術(shù)也被廣泛稱作核糖體分型技術(shù).原核生物含有23S、16S和5S三種 rRNA,其大小分別約為3000、1500和120個(gè)堿基.其中作為小亞單位核糖體RNA的16S rRNA的大小適合于核糖體分型.一般完成l6S rRNA序列測定后,在GenBank中與已知的序列進(jìn)行BLAST分析,從而得出鑒定結(jié)果。

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)分析

這是一種測定基因組限制性片段的DNA指紋技術(shù),通過PCR選擇性地?cái)U(kuò)增整個(gè)基因組DNA的內(nèi)切酶片段,在分辨率高的聚丙烯酰氨凝膠上電泳,產(chǎn)生一組特異的DNA限制性片段的指紋圖譜.與其他DNA指紋技術(shù)相比有其du特的優(yōu)點(diǎn):可用于各種大小不同的基因組的指紋分析,為研究細(xì)菌屬乃至株間的親緣關(guān)系提供一個(gè)有效手段；具有一定的靈活性,可通過特異性PCR引物的設(shè)計(jì)和內(nèi)切酶組合的選擇,調(diào)整AFLP圖譜中限制性片段的適宜數(shù)目；由于適用了嚴(yán)格的PCR條件和高分辨率的聚丙烯酰氨凝膠電泳,因而重復(fù)性好,分辨率高；AFLP不僅僅是簡單的指紋技術(shù),而且可作為連接遺傳圖譜與物理圖譜間的橋梁而用于基因組的研究。

限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析

原理是用限制性內(nèi)切酶將細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行切割,之后在瓊脂糖凝膠上電泳分離,以顯示不同種群基因組DNA的限制性片段長度多態(tài)性.RFLP產(chǎn)生的指紋圖譜更適用于細(xì)菌種間及種內(nèi)株間的分型鑒定。

隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性(RAPD)分析,又稱為隨意引物PCR(AP—PCR)

它是一種DNA指紋多態(tài)性分析技術(shù),其理論依據(jù)是不同的基因組中與隨意引物匹配的堿基序列的位點(diǎn)和數(shù)目可能不同,因而用一組人為設(shè)計(jì)的核苷酸作為引物,通過PCR隨機(jī)擴(kuò)增可產(chǎn)生物種特異性的DNA帶譜。