流式細胞術(shù)廣泛應(yīng)用于細胞表面和細胞內(nèi)分子表達特征的分析，界定不同種類的細胞群，測定分離出的亞類純度，分析細胞的大小和總量，它可以同時分析單個細胞的多個參數(shù)。它主要用于檢測標記在抗體上的熒光強度，這些熒光抗體則可以檢測與特定細胞分子結(jié)合的蛋白或配體，如與 DNA 結(jié)合的溴化丙啶 (PI)等。

　　染色步驟包括：將培養(yǎng)的細胞或組織樣品制成單細胞懸液，然后將細胞放入管子或酶標板中與熒光標記或未標記的抗體孵育。之后將細胞放入流式細胞儀中進行分析。

　　懸浮緩沖液中染色的細胞樣品通過流式細胞儀時，由于鞘液的作用被限制在液流的軸線上，從而通過一個非常小的噴嘴。這種微小的"流液束"使細胞一個接一個地通過激光，細胞/粒子通過通道時散射的光線被多個探測器檢測到。其中光柱前有一個檢測器（稱為前向角散射或簡稱 FSC），它的旁邊有幾個檢測器（稱為側(cè)向散射或簡稱 SSC）。熒光檢測器用于檢測熒光染料本身。粒子/細胞通過光束時，將出現(xiàn)光線散射，散射會通過前向散射和側(cè)向散射被檢測到。散射和熒光數(shù)據(jù)會結(jié)合起來分析。其中前向角散射光與細胞的大小有關(guān)；而側(cè)向角散射則依賴于粒子/細胞的密度（比如胞漿顆粒數(shù)量，細胞膜尺寸），并往往以這種方式，根據(jù)不同的大小和密度的差異而將細胞群區(qū)分開來。當由相應(yīng)激發(fā)波長的激光激發(fā)時，用于檢測或染色的熒光染料就會發(fā)光。這些粒子/細胞就可分別被檢測并進行數(shù)據(jù)分析。

　　直接染色：

　　直接免疫熒光染色時，細胞與直接結(jié)合有熒光染料（如 FITC 標記）的抗體孵育。它的優(yōu)點在于只需要抗體孵育這一個步驟，從而消除了來自二抗的非特異性結(jié)合的可能性。這對細胞內(nèi)染色特別有用，由于大的抗體熒光分子復合物包括二抗被困在細胞內(nèi)造成背景，或甚至無法進入細胞，阻止了一抗的檢測。

　　間接染色：

　　間接染色時，一抗不是熒光染料直接標記的，而是通過熒光染料標記的二抗檢測。另外可選擇使用親和-生wu素系統(tǒng)，即抗體與生物wu素結(jié)合并且通過熒光染料標記的親和素來檢測。隨著標記二抗越來越多的應(yīng)用，可針對不同的目標蛋白制出未標記的一抗，然后用標記二抗進行流式細胞儀分析，這拓寬了研究者對目標蛋白的選擇范圍。

　　細胞內(nèi)染色：

　　應(yīng)用流式細胞術(shù)的細胞內(nèi)源性抗原在染色時，應(yīng)采取各種不同的固定和通透方法，以使抗體能接近胞內(nèi)蛋白。

　　任何情況下，要獲得成功的染色都必須對實驗條件進行優(yōu)化，包括測定抗體效價，采用合適的對照設(shè)定流式細胞儀，并且（如有必要）優(yōu)化樣品的固定和通透方法。

　　選擇熒光結(jié)合染料

　　對一個給定的抗體，從陰性中分辨出陽性細胞的能力，往往取決于所用的熒光結(jié)合染料。

　　各種熒光染料相對強度的一般準則是，從zui亮到zui暗，PE（藻紅蛋白），PE-Cy7，PE-Cy5，APC > APC- Cy7，Alexa Fluor 47，Alexa Fluor 700 > FITC，Pacifi c Blue，Alexa Fluor 488。這是使用信噪比的一般模式，但對于個別抗體仍有些差異。

　　一個高表達的抗原通常可以被幾乎所有的熒光團分辨。一個低強度表達的抗原可能需要使用較亮的 PE 或APC，提信噪比，把未染色細胞中足夠分離出陽性細胞。

　　熒光染料強度的相對差異取決于儀器，這是因為在不同的儀器上激光和過濾器的組合差異。一定要使用適當?shù)腇ACS。

　　流式細胞術(shù)常見問題分析

　　無信號/熒光強度弱

　　不正確的信號補償

　　檢查流式細胞儀陽性單一顏色對照是否正確，通道和補償設(shè)置是否能正確地捕獲所有粒子。

　　沒有足夠的抗體來檢測

　　增加抗體的量/濃度

　　無法接近細胞內(nèi)目標

　　檢查目標蛋白是否在細胞內(nèi)。對于胞內(nèi)染色，確保有足夠的通透性。為防止細胞表面蛋白質(zhì)的內(nèi)化，該過程應(yīng)用冰冷的試劑，在冰上或 4 °C進行，以終止一切反應(yīng)。加入疊氮鈉可防止表面抗原的修飾和內(nèi)化帶來的熒光強度的損失。對于細胞系染色，yi蛋白酶可以引起細胞表面蛋白質(zhì)的內(nèi)化，尤其是細胞表面分子，可能需要更溫和的分離方法。

　　細胞內(nèi)染色結(jié)合熒光分子太大

　　對細胞內(nèi)染色實驗，熒光分子應(yīng)具有較小的分子量。大分子量熒光染料會降低抗體的動力和其進入細胞的可能性。

　　激光器未對齊

　　確保流式細胞儀的激光器正確對齊，必要時通過運行液流檢查微球來調(diào)整路線。如果激光器不能正確對準或發(fā)生漂移時，您可能需要考慮此機的客服。

　　目標蛋白不存在或處于低水平表達，確保組織或細胞類型表達的目標蛋白處于一個足夠檢測的量。

　　可溶性或分泌型目標蛋白

　　目標蛋白是否可溶并從細胞內(nèi)分泌？需要嵌合在細胞膜上或存在于細胞質(zhì)里以便流式細胞儀能很容易檢測到。通過高爾基體封閉的步驟，比如加入 Brefaldin A，可提高細胞內(nèi)染色信號。

　　補償過高或增益過低

　　使用陽性對照再次設(shè)置流式細胞儀，利用補償以確保細胞的熒光信號不被切斷，提高增益以增強信號（在合理的范圍內(nèi)）。

　　熒光分子的熒光逐漸消退，抗體可能放置時間太長或沒有避光，新鮮抗體是必需的。

　　一抗和二抗不匹配

　　二抗應(yīng)該是和一抗來源物種相同（例如*抗體來源于兔，就要使用抗兔的第二抗體）。

　　熒光強度過高

　　抗體濃度過高

　　這將導致較高的非特異性結(jié)合或非常高的熒光強度。減少每個樣本中加入的抗體量。

　　過量抗體被困

　　這是細胞內(nèi)染色特you的問題，較大的熒光分子使抗體被困在細胞中。確保洗滌步驟充分，包括在洗滌緩沖液中加入吐溫或 Triton。

　　封閉不足

　　與封閉步驟一樣，抗體中加入1-3% 封閉試劑。

　　背景高或陽性細胞百分比高

　　增益設(shè)置過高或補償過低

　　使用陽性對照再次設(shè)置流式細胞儀，用補償減少小顆粒背景并減少增益以降低信號。

　　抗體過量

　　降低抗體濃度。您還可以在洗滌緩沖液中添加去污劑，以確保洗去多余的抗體。觀察到兩個或多個細胞群但應(yīng)該只有一群細胞不止一類細胞表達目的蛋白檢查樣品中所有細胞類型的預(yù)期表達水平，如果必要確保細胞充分分離。

　　出現(xiàn)細胞雙峰

　　細胞雙峰在圖上顯示兩倍的熒光強度的第二種細胞類型。染色前輕輕地混合細胞，在放入流式細胞儀前用吸管再次混勻，也可以篩選或過濾細胞以除去團塊（30 μm 的尼龍網(wǎng)）。

　　側(cè)向散射背景偏高（來自小顆粒）

　　細胞裂解

　　確保樣品中細胞沒有裂解和破裂。樣品應(yīng)是新鮮的并且是正確制備的。細胞不能高轉(zhuǎn)速離心或劇烈震蕩。

　　細菌污染

　　確保樣品不受污染。細菌會低水平自發(fā)熒光，這也會導致高粒子率。

　　低粒子率

　　每毫升的細胞數(shù)量太少 制備 1 × 10 6 個細胞/ml。確保細胞充分混合（操作要輕）。

　　細胞聚集，阻塞管道

　　染色前輕輕吹打幾次確保形成同源單細胞懸液。確保運行之前再次混勻。在的情況下，可篩選或過濾細胞以去除團塊（30 μm 的尼龍網(wǎng)）。