Edman降解法

實(shí)驗(yàn)方法原理
主要有質(zhì)譜法，利用蛋白質(zhì)測序儀進(jìn)行測序以及利用蛋白質(zhì)對應(yīng)DNA或mRNA進(jìn)行間接測序。

傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)測序?qū)嶒?yàn)一般包括以下步驟：
1.肽鏈的拆開和分離；
2.測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目；
3.二硫鍵的斷裂；
4.測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計(jì)算出氨基酸成分的分子比；
5.N端、C端的測定；
6.多肽鏈斷裂；
7.測定每個(gè)肽段的氨基酸順序；
8.確定肽段在多肽鏈中的次序；
9.確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。

實(shí)驗(yàn)材料
蛋白質(zhì)樣品
試劑、試劑盒
尿素 鹽酸胍 巰基乙醇
儀器、耗材
蛋白質(zhì)測序儀

實(shí)驗(yàn)步驟
1 多肽鏈的拆分。由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分，一般用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理蛋白質(zhì)，分開蛋白質(zhì)的多肽鏈。
2.測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。
3.二硫鍵的斷裂。幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用碘乙酸（烷基化試劑）保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化。拆開后的肽鏈可用層析或電泳進(jìn)行分離。
4.測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計(jì)算出氨基酸成分的分子比。可用于促進(jìn)測序過程中的錯誤的發(fā)現(xiàn)或區(qū)分模糊結(jié)果。對某些氨基酸頻率的了解也可用于選擇用于蛋白質(zhì)消化的蛋白酶。還可以確定低水平的非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸（例如正亮/氨酸）錯誤摻入蛋白質(zhì)中。

（1）水解。通過將蛋白質(zhì)樣品在6mol/L 鹽酸中加熱至100-110℃24小時(shí)或更長時(shí)間來進(jìn)行水解。具有許多龐大疏水基團(tuán)的蛋白質(zhì)可能需要更長的加熱時(shí)間。一些氨基酸（絲氨/酸，蘇氨/酸，酪氨/酸，色氨/酸，谷氨/酰胺和半胱氨/酸）可能被降解。為了解決這個(gè)問題，Biochemistry Online建議將不同時(shí)間的樣品加熱，分析每種產(chǎn)生的溶液，并推斷回零水解時(shí)間。拉斯特爾建議使用各種試劑來預(yù)防或減少降解，例如硫醇試劑或苯/酚，以保護(hù)色氨/酸和酪/氨酸免受氯的侵襲，并預(yù)氧化半胱/氨酸。他還建議測量釋放的氨的量以確定酰胺水解的程度。

（2）分離和定量。可以通過離子交換色譜法分離氨基酸，然后通過衍生化進(jìn)行檢測。另一種方法是將氨基酸衍生化，然后通過反相HPLC分離。

使用磺化聚苯乙烯作為基質(zhì)進(jìn)行離子交換色譜分析。在酸溶液中加入氨基酸并使穩(wěn)定增加pH的緩沖液通過交換柱。當(dāng)pH達(dá)到它們各自的等電點(diǎn)時(shí)，氨基酸被洗脫。一旦氨基酸被分離，通過添加將形成有色衍生物的試劑來確定它們各自的量。如果氨基酸的量超過10nmol，則可以用茚三酮，它與脯/氨酸反應(yīng)時(shí)呈黃色，與其他氨基酸發(fā)生鮮艷的紫色。氨基酸的濃度與所得溶液的吸光度成比例。非常少量或者低于10pmol的氨基酸，可以使用諸如鄰苯二甲醛（OPA）或熒光胺的試劑形成熒光衍生物。

柱前衍生化可以使用Edman試劑產(chǎn)生的衍生物可通過UV光檢測。使用產(chǎn)生熒光衍生物的試劑可以獲得更高的靈敏度。將衍生化的氨基酸進(jìn)行反相色譜，通常使用C8或C18 二氧化硅柱和優(yōu)化的洗脫梯度。使用UV或熒光檢測器檢測洗脫的氨基酸，并將峰面積與衍生化標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積進(jìn)行比較，以量化樣品中的每種氨基酸。

5.分析多肽鏈的N-末端和C-末端。
（1）N末端分析法：（2，4-二硝基氟苯（DNFB）法；異硫氰酸苯酯（PITC）法；丹黃酰氯（DNS）法；氨肽酶法）；
（2）C末端分析法（肼解法；酶降解法；硼氫化鋰法）。

6.多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段。
分解肽鏈可通過內(nèi)肽酶如胰蛋/白酶或胃蛋/白酶或通過化學(xué)試劑如溴化氰進(jìn)行。不同的酶產(chǎn)生不同的切割模式，并且片段之間的重疊可用于構(gòu)建整體序列。

7.測定每個(gè)肽段的氨基酸順序
將待測序的肽段吸附在固體表面上（一種常見的基材是涂有聚苯乙烯（一種陽離子聚合物）的玻璃纖維），將異硫氰酸苯酯（PITC）與12％三甲胺的溫和堿性緩沖溶液一起加入到吸附的肽中，與N-末端氨基酸的胺基反應(yīng)。然后可以通過加入無水酸選擇性地分離末端氨基酸。然后衍生物異構(gòu)化得到取代的苯基乙內(nèi)酰脲，其可以洗掉并通過色譜法鑒定，并且可以重復(fù)該循環(huán)。每個(gè)步驟的效率為約98％，允許可靠地確定約50個(gè)氨基酸。

序列測定也可以直接用蛋白質(zhì)序列分析儀。將蛋白質(zhì)或肽的樣品固定在蛋白質(zhì)測序儀的反應(yīng)容器中并進(jìn)行Edman降解。每個(gè)循環(huán)從蛋白質(zhì)或肽的N-末端釋放并衍生出一個(gè)氨基酸，然后通過HPLC鑒定釋放的氨基酸衍生物。對整個(gè)多肽重復(fù)進(jìn)行測序過程，直到建立整個(gè)可測量序列或預(yù)定數(shù)量的循環(huán)。

8.確定肽段在多肽鏈中的次序。
利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。

9.確定原多肽鏈中二硫鍵的位置
根據(jù)已知氨基酸順序選擇合適的專一性蛋白質(zhì)水解酶（一般采用胃蛋/白酶）在不打開二硫鍵的情況下部分水解蛋白質(zhì)，再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個(gè)肽段，用過甲酸處理后，將可能含有二硫鍵的肽段進(jìn)行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。         

注意事項(xiàng)
1.樣品純度不能太低，經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為純度大于90%的蛋白才適用于測序反應(yīng)。
2.N端封閉或糖基化的蛋白質(zhì)難以進(jìn)行Edman反應(yīng)，無法測序。

其他的蛋白質(zhì)測序方法還有：
1.可通過Edman降解確定的短蛋白質(zhì)序列（10至15個(gè)殘基）被翻譯成DNA序列，用作探針或引物以分離相應(yīng)基因或互補(bǔ)DNA的分子克隆。然后測定克隆DNA的序列并用于推斷蛋白質(zhì)的完整氨基酸序列。
2.蛋白質(zhì)從頭測序（De novo sequencing），又叫全新蛋白測序。這項(xiàng)技術(shù)是根據(jù)肽段與惰性氣體相碰撞產(chǎn)生的一系列的有規(guī)律的片段離子之間的質(zhì)量差來推斷氨基酸序列。我們可以根據(jù)肽鍵斷裂處的y離子和b離子來推測氨基酸序列，以及翻譯后修飾。De novo sequencing有一項(xiàng)突出的優(yōu)勢，是傳統(tǒng)質(zhì)譜測序不能達(dá)到的，那就是不依賴任何蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，對未知蛋白質(zhì)從頭測序。