在細胞和基因的微觀世界中研究探索，遺傳報告基因是非常有用的"可視化和量化"工具，具有廣泛的應(yīng)用。熒光素酶（螢光素酶）以出色的靈敏度、使用方便、可以定量檢測而成為理想的報告基因。

熒光素酶不是特定的分子，是一類中能催化產(chǎn)生生物發(fā)光的酶的統(tǒng)稱，不同來源的熒光素酶各有特點，可催化底物發(fā)出不同顏色的光，有的還可以配合進行雙色發(fā)光檢測。這種酶最早的來源，也是最有代表性一種來自學名為Photinus pyrali'的北美螢火蟲體內(nèi)的螢光素酶，之所以稱為螢光素酶，一方面也有助于區(qū)分需要激發(fā)光源才可以生成激發(fā)熒光的熒光蛋白，而螢光素酶是一個催化底物分解的發(fā)光反應(yīng)，熒光素酶在細胞內(nèi)沒有背景，因此可以檢測非常微弱的表達，靈敏度更高。不過，隨著發(fā)光檢測設(shè)備的不斷推進和升級，生物發(fā)光靈敏度高，檢測方便的優(yōu)勢使得這類酶與熒光蛋白一起漸有取代其他報告基因的趨勢。于是，越來越多新的并非來自螢火蟲的新熒光素酶進入市場，不再是“螢光"的天下了。  

種類更多 
來自螢火蟲的熒光素酶是最/經(jīng)典的熒光素酶，這個61KD單體酶無需修飾直接具有酶活，催化反應(yīng)依賴ATP，很適合作為遺傳報告基因，也最為人熟知；此外還有Renilla（海腎）熒光素酶，只有36KD大小的蛋白，底物是腔腸素，只需要氧氣，不需要ATP，發(fā)藍色光，一直是螢火蟲熒光素酶的替代，并常與螢火蟲熒光素酶組合成為雙色檢測，或者作為內(nèi)對照。

那么，讓我們來看看現(xiàn)在有哪些新熒光素酶了？
1. Gaussia熒光素酶，這是一種分泌型的藍色熒光素酶，蛋白分子量更小，只有22KD，含有天然的分泌型信號肽，可以引導熒光素酶分泌到細胞培養(yǎng)上清中，從而無需裂解細胞即可檢測報告基因活性。所表達的熒光素酶85%以上都會分泌至胞外，不過由于這種分泌型熒光素酶產(chǎn)生的信號比來自Firefly（螢火蟲）或Renilla（海腎）的信號強很多倍，所以還可以在細胞裂解物中檢測到細胞內(nèi)殘留的熒光素酶。分泌表達為檢測帶來很大的方便——不需要裂解珍貴的細胞，即可作活細胞實時動力學分析，連續(xù)時間曲線研究。可與紅色螢火蟲熒光素酶組合為雙色檢測系統(tǒng)。

2. Cypridina（海螢）熒光素酶也是一種分泌型熒光素酶，呈美麗的藍紫色，蛋白分子量大小有62KD。同Gaussia一樣，大部分熒光素酶產(chǎn)物會分泌到胞外，可對活細胞實施連續(xù)檢測，非常方便。由于信號很強，細胞內(nèi)殘留的熒光素酶還足以進行常規(guī)的裂解細胞檢測，可實現(xiàn)多重檢測。Cypridina（海螢）熒光素酶可與紅色螢火蟲熒光素酶組合為雙色檢測。

3. Red Firefly（紅色螢火蟲）熒光素酶是一種胞內(nèi)蛋白，與天然Firefly（螢火蟲）熒光素酶(綠色)相比，其發(fā)射峰遷移至紅光光譜區(qū)。這對于一直以來都是“綠肥紅瘦"的熒光素酶真是好消息。正是由于Red Firefly（紅色螢火蟲）熒光素酶的這種光譜遷移，使其能夠與Gaussia、Cypridina（海螢）或Green Renilla（綠色海腎）熒光素酶很好地區(qū)分開，從而可以組合使用。

4. 可共用同一底物的紅、綠兩色的叩頭蟲螢光素酶，大小一致，底物一致，相差只有幾個氨基酸，是雙色檢測的好選擇。

5. Green Renilla（綠色海腎）熒光素酶是一種胞內(nèi)蛋白，與天然的Renilla（海腎）熒光素酶相比，在血清中穩(wěn)定性更高，發(fā)光強度更好。因此，使用綠色海腎（Green Renilla）熒光素酶報告基因檢測靈敏度更高。

同樣作為理想報告基因的熒光蛋白如GFP如今早也已經(jīng)是繽紛的七彩世界了，那么熒光蛋白和熒光素酶各自的特點在哪里呢？熒光蛋白并不是自身發(fā)光，而是需要一個激發(fā)光源才可以生成發(fā)射熒光，其發(fā)光能量來自于激發(fā)光。熒光蛋白的優(yōu)點在于檢測不需要底物，無創(chuàng)，也不需要干擾細胞即可進行連續(xù)檢測；但激發(fā)光會引起背景熒光干擾（細胞、容器等在激發(fā)光源下也會產(chǎn)生一定的熒光），通常用于定性，或者半定量。
而熒光素酶發(fā)光是一個酶促反應(yīng)，需要加入底物后才有發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生。分泌型的熒光素酶需要取出上清進行反應(yīng)，對于胞內(nèi)表達的熒光素酶來說還需要裂解細胞才能檢測。其優(yōu)點在于熒光素酶在細胞內(nèi)沒有背景，因此可以檢測非常微弱的表達，具有超高的檢測靈敏度及寬廣的動力學檢測范圍，可以精確定量。

檢測試劑靈敏度更高
如今的熒光素酶來源各不相同，各有所長，對應(yīng)的檢測試劑自然也越來越多花樣和講究。在過去只有螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶的時代，因為這兩者都是胞內(nèi)表達，要檢測需要先裂解細胞，而且螢火蟲螢光素酶催化底物發(fā)光的持續(xù)時間比較短，對于批量處理來說需要配備自動進樣裝置的檢測設(shè)備，委實有點兒麻煩。如今有了分泌型表達的熒光素酶，就可以直接取上清進行檢測，無需裂解細胞，可作活細胞實時動力學分析，進行連續(xù)時間曲線研究，這就方便多了。分泌型熒光素酶進入液相后會不會因為稀釋而大大降低信號強度？這看來不用擔心，兩大類分泌型的熒光素酶催化底物的發(fā)光信號比原來的螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶要高出2-3個數(shù)量級，自然更靈敏，更適合微孔板檢測。
不僅如此，如今熒光素酶檢測試劑可根據(jù)所產(chǎn)生的發(fā)光信號持續(xù)時間長短而細分為閃光型和輝光型。閃光型和輝光型發(fā)光信號的主要區(qū)別是它們的動力學行為不同。加入底物后，閃光型發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生瞬時的發(fā)光信號，而輝光型發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生穩(wěn)定的發(fā)光信號，有的可持續(xù)數(shù)小時。不難想象，通常閃光型發(fā)光強度會更大，檢測靈敏度比同類的輝光型酶發(fā)光強度更高。但輝光型檢測試劑因為發(fā)光持續(xù)時間長，無需使用自動進樣器，批處理起來也容易些。在選擇檢測試劑時需要特別注意。

單螢光素酶檢測的選擇相當豐富，研究人員可以根據(jù)研究的需要自由組合不同的熒光素酶進行多重檢測。

神奇的雙報告檢測新方法

說到多重檢測，值得注意的是，在用熒光素酶定量基因表達時，通常會采用第二個報告基因作為內(nèi)對照，使第一個報告基因的檢測均一化，從而減少實驗的變化因素干擾，比如, 培養(yǎng)細胞的數(shù)目和活力的差別, 細胞毒性，細胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率等。

雙熒光素酶檢測可用于以下研究方向：
同時分析多個調(diào)控元件
同時分析多個信號轉(zhuǎn)導通路
單次篩選一個以上的靶點，包括脫靶效應(yīng)
分析兩個或多個通路之間的相互作用
雖然在過去，也有采用熒光素酶結(jié)合氯霉/素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)組合作為雙報告基因體系，但熒光素酶定量檢測可在幾秒鐘內(nèi)完成, 而CAT, β-Gal和GUS則需要長時間的預(yù)處理；許多類型的細胞有內(nèi)源β-Gal或GUS表達, 不利于準確定量報告基因的表達, 采用高溫下預(yù)處理細胞裂解液可降低內(nèi)源性β-Gal和CAT的干擾，但這些處理也會快速失活熒光素酶。因此,在此類雙報告基因檢測中, 必須以不同的步驟分別處理共轉(zhuǎn)染的細胞裂解液，相當麻煩。

雙螢光素酶報告基因技術(shù)，結(jié)合了螢火蟲熒光素酶檢測和海洋腔腸熒光素酶檢測，可在單管中進行雙熒光素酶報告基因檢測,快速,靈敏,簡便。但是早期的雙螢光素酶技術(shù)需要先裂解細胞，檢測螢火蟲螢光素酶，然后淬滅螢火蟲螢光同時激活海腎螢光素酶，再做第二個檢測，看起來有點麻煩，如今提供了Dual-Glo改進成為加樣-檢測的均質(zhì)試劑。
不過最/方便的還是雙分泌型檢測：這是一種兩步法的檢測，可用于實時監(jiān)測Gaussia分泌型熒光素酶和Cypridina（海螢）分泌型熒光素酶。這個雙報告系統(tǒng)可對來自同一細胞培養(yǎng)上清的熒光素酶進行動力學測定，靈敏度高，不僅節(jié)省了樣品處理時間，還降低了檢測的差異性。這兩種發(fā)光波長接近，不能用濾光片區(qū)分，需要將上清分為兩組分別用兩種底物檢測兩種酶活性。由于兩種熒光素酶的底物*不同，所以可以有效區(qū)分兩種酶的活性。

除了雙分泌型檢測，還有3組雙報告基因檢測（檢測胞內(nèi)熒光素酶）：
Gaussia –Red Firefly熒光素酶
Cypridina –Red Firefly熒光素酶
Green Renilla –Red Firefly熒光素酶

這是以光譜范圍來分辨兩種不同熒光素酶所產(chǎn)生的發(fā)光信號的方法，只需一步操作可實現(xiàn)雙重檢測。只用添加一種試劑（包含兩種底物），即可通過轉(zhuǎn)換濾光片對兩種發(fā)光信號同時進行檢測。這樣就可以省去了淬滅步驟和分步檢測的麻煩，在同一個樣品中同時對不同熒光素酶活性進行測定，操作簡單，結(jié)果同步性更好。其中的關(guān)鍵在于，每個組合中的兩個報告基因的發(fā)射光譜波長相差足夠遠，能讓儀器很好的區(qū)分開。這時可以看出Red Firefly熒光素酶的光譜紅移的重要意義了吧。值得一提的是兩種分泌型熒光素酶，前面介紹過，雖然大部分的表達產(chǎn)物分泌到胞外，但細胞內(nèi)仍有足夠強的熒光素酶活性，可用閃光或輝光型檢測試劑來檢測。

在實用中，熒光素酶的優(yōu)勢在于*的靈敏度和寬廣的動態(tài)范圍可方便的進行定量分析。熒光素酶的靈敏度很大程度取決于產(chǎn)生熒光的強度。比較下來，分泌型熒光素酶，Cypridina（海螢）和Gaussia熒光素酶的發(fā)光強度最高，其次是Renilla（海腎）熒光素酶，最后是Firefly（螢火蟲）熒光素酶。
其他應(yīng)用
熒光素酶可被用做單報告基因在特定生物實驗中研究某一生物學事件。因不同熒光素酶的發(fā)光光譜特性和底物都是不一樣的，所以還可以將多個不同的熒光素酶組合使用，進行多重檢測。

多重檢測更適用于以下方面：
同時研究多個基因的表達調(diào)控
降低脫靶效應(yīng)
識別兩個或多個信號通路間的相互作用
將實驗體系產(chǎn)生的“假象"歸一化

應(yīng)用
啟動子研究中分析順式作用元件和反式作用因子
藥物篩選
siRNA和miRNA篩選
分泌途徑及蛋白定位報告基因檢測
活細胞的實時動態(tài)研究
信號轉(zhuǎn)導通路分析
難轉(zhuǎn)染的細胞（包括干細胞和原代細胞）的研究
RNA 剪接研究