細胞培養是一項艱難的工作。因為這是一個高度技術性的過程，當你從一個來源提取細胞并在另一個條件下去對他們進行操作時，可能會出現很多問題，比如受到外界的污染，或者生長速度非常緩慢。

但其中也有許多是我們可以去控制的。在過去的100多年里，貼壁細胞培養實驗為現代醫學的一些最ju革命性的進步做出了貢獻，促進了我們對癌癥等疾病的理解，并支撐了安全有效的治療方法的發展。

幸運的是，現在人們對細胞培養的了解比20世紀初體外培養先驅羅斯·哈里森（Ross Harrison）在玻片上分析青蛙組織時多得多。下面跟著遠慕一起來看看培育活細胞的基本知識，包括如何接種、增殖和收獲。

低溫狀態下的細胞接種

在購買細胞培養品系時，產品是冷凍保存的，這對長期保持細胞活力是必要的。在這種狀態下，你需要解凍并進行細胞接種，這個過程應當是非常謹慎小心的，即便它發生得很快。然而，這一重要的步驟的經常匆忙進行，有時很多細節甚至被忽視，這就存在了細胞被污染的風險，也沒有給細胞提供它們所需要的良好的、無菌的開始。

以下是進行細胞接種的正確方法：

準備好所需的所有的器具。你需要一個冷凍的小瓶子、一個燒杯或水浴槽，裝滿預熱的水，和一個裝有預平衡介質的燒瓶。如果你打算降低細胞的活躍度并去除DMSO或其他低溫保護劑，你還需要一個錐形瓶用于盛裝這些介質。

加熱小瓶子。在裝有預熱過的水的燒杯中輕輕攪動冷凍的小瓶子，直到里面的組分幾乎wan全融化。然后，用酒精濕巾清潔小瓶，以減少被污染的風險。

接種細胞。使用移液管，從冷凍液中取出細胞并轉移到燒瓶中。然后用移液器反復吸取混勻溶液，以便接種。這樣，你的細胞就會被解凍、轉移、并準備好進入培養箱（或用于去除DMSO的離心機）。

細胞數量隨著細胞增殖而擴大

當細胞生長到一定密度后，需要對細胞進行分離傳代。你需要掌握正確的細胞分離方法。細胞增殖是細胞培養的必要部分，依賴于效率和一致性。如果使用的工作流程效率低下，可能會提高供應和人工成本；如果遵循了前后不一致的工作流程，則可能會給您的細胞帶來過度壓力，并殺死它們。

達到目的的方式取決于你的對于實驗容器的選擇。市面上有非常多的選擇，比如使用i-Quip?容器，可以幫助生命科學家在更小的空間中建立友好的環境，以實現更快的生長，也更多的減少勞動力和污染風險。

因為不是所有的容器都具有相同的生長面積，研究人員通常會考慮細胞/cm2的產量來決定他們的容器選擇和相關試劑的用量。然后，他們將利用這一技術持續地進行細胞接種實驗，使其達到研究人員所需的細胞數量。為了獲得最佳生長效果，通過以下操作保持細胞/cm2和mL/cm2的比例穩定來選擇容器和試劑：

使用這個公式來計算您的細胞數量，以容器為單位：[(所需細胞/cm2)×(容器的面積cm2)]；

應用這個公式來計算每個容器所需的試劑量：[(期望mL數/ cm2)×(容器的面積cm2)]。為了達到最佳的細胞生長和氣體擴散，大多數情況下每cm2的細胞生長面積將需要0.2 mL到0.5 mL的培養基。

收獲你的貼壁細胞

當細胞在顯微鏡下呈現為單層時，你就知道它們已經準備好被收獲了。實驗員們一般會通過化學或物理手段分離細胞。

一種方法是通過解離試劑進行化學分離，需要針對細胞類型和應用進行優化，以確保細胞不受試劑的負面影響。相比之下，對于可能不耐受解離試劑的強黏附、敏感細胞，通過細胞刮除器進行物理清除可能是更好的方法。同時還需要考慮下游應用場景，以及如何或是否解離試劑可能影響您的研究。

如果您選擇使用解離試劑，請使用移液管無菌地遵循以下操作步驟：

從培養瓶中取出培養基；

向培養瓶中加入PBS等緩沖溶液，以去除可能干擾解離劑的任何微量血清。輕輕搖動容器，使里面的溶液均勻。浸泡10到15分鐘以分離哪些難以分離的細胞系。移去緩沖液；

以0.02到0.03 mL/cm2的比例添加解離試劑。根據細胞系或解離試劑的特性，在37℃孵育可以促進解離；

當細胞狀態呈現圓形，但還沒有開始聚集時，它們就已經準備好了——就好像你在看一個充滿了成千上萬顆星星的夜空。溶液開始變得渾濁是一個好跡象，表明它們已經準備好被分離了；

用緩沖液或含血清的培養基稀釋解離試劑，通常以1:1的比例稀釋。在去除整個溶液并將其轉移到試管內之前，上下吸取幾次以混勻；

如果細胞對試劑特別敏感，則建議通過離心法實現細胞的分離。

現在你的細胞可以計數了，同時也可以對其細胞密度和活力進行測量了。

通過細胞培養達成你的研究

貼壁細胞培養可以為你的實驗室打開一個實驗和下游應用的全新世界——它同樣也可以很有趣。但當你操縱活體細胞時，可能會有很多風險，所以正確的操作非常重要。通過遵循這些基本的指示，并努力達成更完善的操作流程，你可以逐步成長為一個細胞培養專家。