引物的設計和選擇符合熒光PCR的探針并進行設計對于實時熒光PCR尤其重要。可以說，不合理的設計意味著絕對的失敗。但是，好的設計并不等于好的實驗結果，影響PCR和熒光PCR的因素非常多，下面擇其重要進行介紹。
3.1 引物退火溫度
引物的一個重要參數是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm低5℃。
設定Tm有幾種公式。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。大部分計算機程序使用近鄰分析法——從序列一級結構和相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩定性。所有oligo軟件會自動計算引物的Tm值。在設置退火溫度時可以如下進行：以低于估算的Tm5℃作為起始的退火溫度，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。為獲得最佳結果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會由于在循環中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設定為比最di低的Tm低5℃。或者為了提高特異性，可以在根據較高Tm設計的退火溫度先進行5個循環，然后再根據較低Tm設計的退火溫度進行剩余的循環。這使得在較為嚴謹的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
3.2 引物濃度
引物的濃度會影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會導致非特異性產物擴增。為了確定引物濃度，可以在260nm（OD260）測量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系數的倒數（nmol/OD），通過Beers法則（公式1）計算引物濃度。
微摩消光系數可以使用公式2計算。與大分子雙鏈DNA可以使用平均消光系數不同，確定引物的精確濃度必須使用計算的消光系數。這是因為引物較短，堿基組成差異很大。在oligo軟件上可以計算出引物的的消光系數（OD/μmol）和消光系數的倒數（μmol/OD）。
一般商業合成的引物以O.D.值表示量的多少，在一般情況下，20個堿基長的引物，1個O.D.加100ul水后引物濃度為50pmol/ul（50μM）。也可以用OLIGO軟件，根據引物的的消光系數（OD/μmol），計算出一定的工作濃度下，引物的加水量。
濃度(μM)＝A260（OD/ml）×稀釋系數×消光系數的倒數（nmol/OD）
舉例：計算某寡核苷酸（溶于1ml水中），取其中的10μl稀釋100倍（加入990μl）水中。在A260處測吸光度為0.2。計算消光系數的倒數為4.8 nmol/OD，代入得：
濃度＝0.2（OD/ml）×100×4.8（nmol/OD）＝96nmol/ml＝96μM
3.3 引物、探針的純度和穩定性
定制引物的標準純度對于大多數PCR應用是足夠的。部分應用需要純化，以除去在合成過程中的任何非全長序列。這些截斷序列的產生是因為DNA合成化學的效率不是100％。這是個循環過程，在每個堿基加入時使用重復化學反應，使DNA從3'到5'合成。在任何一個循環都可能失敗。較長的引物，尤其是大于50個堿基，截斷序列的比例很大，可能需要純化。
引物產量受合成化學的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100μM。也可以用雙蒸水溶解。
引物的穩定性依賴于儲存條件。應將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃可以穩定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存2個月。
探針即寡核苷酸進行熒光基團的標記，標記本身有效率的區別。探針標記以后一般應該純化，純度高、標記效率高的探針不僅熒光值高，且保存時間可以高達一年以上。不同的生物技術公司探針標記效率和純度有很大的區別。
由于反復凍融易導致探針降解，在確認探針質量好的情況下，最好稀釋成2uM（10×），作為工作濃度分裝多支，避光保存。
3.4 熱啟動
熱啟動PCR是除了好的引物設計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進行PCR反應配制過程中，以及在熱循環剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產生非特異性的產物。這些非特異性產物一旦形成，就會被有效擴增。在用于引物設計的位點因為遺傳元件的定位而受限xian時，如定點突變、表達克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構建和操作，熱啟動PCR尤為有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應液，并將其置于預熱的熒光定量PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能wan全抑制酶的活性，因此并不能wan全消除非特異性產物的擴增。
熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合酶在內的大部分手工熱啟動方法十分煩瑣，尤其是對高通量應用。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分，如鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。象手動熱啟動方法一樣，蠟防護層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應用。
Transitor® Hot Start Taq酶對于自動熱啟動PCR來說高效可靠。Transitor® Hot Start Taq是在常規Taq酶的基礎上進行了化學修飾，使得該酶在低溫或常溫下沒有酶活，因此在加樣至PCR擴增前，不會產生由于引物隨機粘連而形成的非特異性擴增。高溫條件下，化學修飾集團會被剪切，從而釋放酶活。此外，隨著PCR擴增的進行，酶活會被逐步釋放，有效提高擴增效率及產物量。Transitor® Hot Start Taq DNA聚合酶在變性步驟的95℃保溫過程中要持續20分鐘才會被釋放到反應中，從而wan全恢復聚合酶活性。
3.5鎂離子濃度
鎂離子影響PCR的多個方面，如DNA聚合酶的活性，這會影響產量；再如引物退火，這會影響特異性。dNTP和模板同鎂離子結合，降低了酶活性所需要的游離鎂離子的量。最佳的鎂離子濃度對于不同的引物對和模板都不同，但是包含200μM dNTP的實時定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液（普通PCR是1.5mM）。較高的游離鎂離子濃度可以增加產量，但也會增加非特異性擴增，降低忠實性。為了確定最佳濃度，普通PCR從1mM到3mM，以0.5mM遞增，進行鎂離子滴定。為減少對鎂離子優化的依賴，可以使用 Transitor® Hot Start Taq酶。Transitor® Hot Start Taq DNA聚合酶能夠在比一般的Taq DNA聚合酶更廣的鎂離子濃度范圍內保持功能，因此僅需較少的優化。
3.6 模板質量
模板的質量會影響產量。DNA樣品中發現有多種污染物會抑制PCR。一些在標準基因組DNA制備中使用的試劑，如SDS，在濃度低至0.01％時就會抑制擴增反應。分離基因組DNA較新的方法包括了DNAZol，一種胍去垢劑裂解液，以及FTA Gene Guard System，其可以同基質結合，在血液及其他生物樣品中純化貯存DNA。應注意進行PCR 反應的模板質量，以增加PCR 反應的成功率。
3.7 模板濃度
起始模板的量對于獲得高產量很重要。對大多數PCR擴增和熒光PCR擴增，104到106個起始目的分子就足以觀測到好的熒光曲線（或在溴化乙錠染色膠上觀察到）。所需的最佳模板量取決于基因組的大小（下表）。舉例說，100ng到1μg的人類基因組DNA，相當于3×104到3×105個分子，足以檢測到單拷貝基因的PCR產物。質粒DNA比較小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg級的。對于一般的檢測樣品，10——100ng的量就足夠檢測了。當然對模板做一個梯度稀釋，對于定量PCR而言是非常容易，且能分析擴增效率。
表1. 基因組大小和分子數目的比例
基因組大小和分子數目的比例
3.8 防止殘余（Carry-over）污染
PCR易受污染的影響，因為它是一種敏感的擴增技術。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴增。當前一次擴增產物用來進行新的擴增反應時，會發生共同來源的污染。這稱之為殘余污染。從其他樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會是污染源（非殘余污染）。
可以在PCR過程中使用良好的實驗PCR步驟減少殘余污染。使用帶濾芯的移液管可以阻止氣霧劑進入eppendorf管內。為PCR樣品配制和擴增后分析設計隔離的區域，在準備新反應前更換手套。總是使用不含有模板的陰性對照檢測污染。
使用預先混合的反應成分，而不是每個反應的每個試劑單獨加入。
一種防止殘余污染的方法是使用尿mi啶DNA糖基化酶（UDG）。這種酶（也稱為尿嘧mi啶-N-糖基化酶或UNG）移除DNA中的尿嘧mi啶。在擴增過程中將脫氧尿嘧mi啶替換為胸腺嘧啶使得可以把前面的擴增產物同模板DNA區分開來。因為前面的擴增產物對UDG敏感，所有可以在PCR前對新配制的反應用UDG處理以破壞殘余產物。
